1912年。ユタ州でボーイスカウトに参加していた少年・インディ（リバー・フェニックス）は“コロナドの十字架”を盗掘している男たちと遭遇。この時、インディは、人類の遺産は博物館に納めるべきものと、盗掘者たちから十字架を奪うが、結局悪党一味に丸め込まれてしまう。それから26年後の1938年。大学で教べんをとるインディは、大富豪ウォルター・ドノヴァン（ジュリアン・グローバ―）からイエス・キリストの血を受けたといわれている“聖杯”の捜索を依頼される。それはインディの父で中世史学者であるヘンリー・ジョーンズ（ショーン・コネリー）が生涯をかけて研究しているものだった。ドノヴァンによると、当初ヘンリーに聖杯の捜索を依頼していたのだが、ヘンリーは行方不明になってしまったという。インディは、ヘンリーから託された“聖杯日誌”を手掛かりに、マーカス・ブロディ（デンホルム・エリオット）と共に、ベニスへと飛んだ―。